SP6: Transgene Modelle für die Dystonie

Principle Investigator: Michael Sendtner

Das Teilprojekt 6 des Dystract-Verbunds verfolgt zwei Ziele:

1. Generierung neuer Mausmodelle für die Dystonie auf der Basis von Mutationen in den Genen für Dyt1, Dyt6 und Dyt25.

2. Im zweiten Projektteil sollen an diesen und anderen Mausmodellen Veränderungen des BDNF-Signalwegs in den kortikostriatalen Neuronen untersucht werden. Zentrale Hypothese ist, dass eine Störung der BDNF-Signalübertragung an den kortikostriatalen Synapsen zur gestörten Motorik bei diesem Krankheitsbild beiträgt.

Es wurden klassische transgene Mäuse hergestellt, die sowohl das wildtypische THAP1 als auch das in Dystonie-Patienten mutierte THAP1F81L exprimieren. Inzwischen stehen auch erste Mäuse mit einer Mutation im GNALS293X zur Verfügung. Weitere Mausmodelle werden mit konventionellen Methoden im Jahr 2017 und 2018 hergestellt. Diese Mausmodelle sollen im Verbund phänotypisch und pathologisch untersucht werden, ob sie sich als Mausmodelle für die Dystonie eignen.

BDNF ist ein wichtiger neurotropher Faktor für die Regulation der synaptischen Plastizität an kortikostriatalen Synapsen. Dieser neurotrophe Faktor wird in kortikalen Projektionsneuronen synthetisiert, anterograd axonal transportiert und an Axonterminalen im Striatum freigesetzt. Da die Mengen des BDNF-Proteins sehr niedrig sind, war es bisher nicht möglich, BDNF in den axonalen Terminalen kortikostriataler Projektionen nachzuweisen. Aus diesem Grund werden derzeit Methoden optimiert, um die Rolle von BDNF in diesen synaptischen Verbindungen zu charakterisieren. Auf der Basis von Arbeiten zur Optimierung des Nachweises von BDNF im Gehirn (Abb. 1, BDNF Immunreaktivität im Hippocampus), sollen bis 2018 Methoden optimiert werden, um BDNF auch im Striatum sicher nachweisen zu können.

Abb. 1: Lokalisation von BDNF Immunreaktivität (rot, Dyelight 550) mit der Immunreaktivität für den Glutamattransporter VGluT1 in der CA3-Region des Hippocampus (Alexa 488, grün). BDNF ist in Axonterminalen der Moosfasern lokalisiert, die in die CA3-Region projizieren.
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Vorangegangene Untersuchungen hatten gezeigt, dass die genetische Inaktivierung von BDNF im Gehirn mittels Tau-Cre konditioneller Rekombination zu massiven Veränderungen im Striatum führt (Abb. 2). Das Volumen des Striatums ist um ca. 40% bei BDNF defizienten Mäusen reduziert und die verbleibenden medium spiny neurons zeigen eine deutliche Reduktion dendritischer Arborisierung sowie von postsynaptischen dendritischen Spines (Rauskolb et al., J. Neuroscience 2010). Diese Befunde sind Grundlage für die Hypothese, dass Störungen des anterograden Transports von BDNF in kortikostriatalen Neuronen, Störungen in der synaptischen Freisetzung solcher BDNF-positiver Vesikel, sowie Störungen der postsynaptischen Aktivierung von Trk-B für funktionelle motorische Defizite verantwortlich sind und dass die kortikostriatalen Synapsen, die eine zentrale Schaltstelle innerhalb des direkten und indirekten Signalwegs für die Regulation der Motorik darstellen, eine wichtige Funktion in der Pathologie der Dystonie spielen könnten.

Abb. 2: Depletion von BDNF in Neuron-spezifischen BDNF-Gen-Knockout-Mäusen führt zur massiven Reduktion dendritischer Arborisierung in medium spiny neurons (MSNs) im Striatum (Rauskolb et al., J. Neuroscience 2010.

Um diese Hypothese zu verfolgen, wurden histologische Techniken zum Nachweis des direkten und indirekten Signalwegs optimiert (Abb. 3), die nun Grundlage dafür sind, die entsprechenden Synapsen und Schaltkreise für die Motorik und potenzielle Veränderungen bei BDNF-defizienten Tieren sowie bei den neu generierten Mausmodellen für Dystonie untersuchen zu können.

Fig. 3: Spezifische Detektion von D2 medium spiny neurons, indirekter pathway im Striatum (grün, Alexa 488, GFP) in transgenen Mausmodellen. DARPP32 Immunreaktivität (rot, Cy3) färbt alle striatalen medium spiny neurons, auch die D1 positiven Neurone des direkten Signalwegs aus den Basalganglien.
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Um solche potenziellen Veränderungen in der BDNF-Signaltransduktion auch auf postsynaptischer Seite untersuchen zu können, wurden Zellkulturtechniken optimiert, mit denen sowohl die medium spiny neurons des direkten Signalwegs (D1) und des indirekten Signalwegs (D2) spezifisch angereichert und in Zellkultur separat untersucht werden können (Abb. 4). Solche Techniken standen bislang nicht zur Verfügung und sollen bis 2018 so optimiert werden, dass sie für zellbiologische und molekulare Untersuchungen zu Veränderungen des BDNF Trk-B Signalings in medium spiny neurons angewandt werden können.

Abb. 4: Isolierte medium spiny neurons aus dem Striatum von Reportermäusen. Die mit FACS angereicherten D2-positiven Neurone des indirekten Signalwegs sind in grün (GFP) gefärbt, alle medium spiny neurons in rot (DARPP32, Cy3).
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